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Molecular Devices测定癌细胞球培养物形态学特征的共聚焦成像及3D图像分析

点击次数:660 发布时间:2017-05-15

前言:

如今,越来越多的研究者将兴趣投入到利用三维(3D)类器官培养物作为组织生物学和癌症 模型。发展可对3D模型表型变化做定量分析的高通量检测技术是当前研究的热门。研究的目 的是为了发展高通量的高内涵成像和分析方法,这种方法可用于检测和分析人类癌细胞球经化 合物处理后的形态学特征的改变。我们优化了针对三种普通癌细胞系使用低附着U型底多孔板 或固体培养基的细胞球培养方案,并改进了工作流程,开发出一步染色法,减少了可变性。我 们利用共聚焦成像方式采集3D基质和物体的多层切片图像,有效实现不同细胞球表型之间的 比较。2D和3D图像分析方法用于提供单细胞和细胞球表型的多参数特征描述。我们报导了一 些结果数据,包括对数量、大小、形状和类器官的特征描述,总的或者特异性标记的细胞数量, 还有细胞活力和凋亡的测定。我们得到一系列已被证实的抗癌药物和细胞毒性药物处理后的不 同读数及IC50值以阐明浓度应答效应。我们所推荐的方法可以提高使用3D细胞模型进行化合物 筛选和抗癌药物评价的高内涵检测手段的表现及通量。

 

目的:

研究目的是优化工作流程、开发新的成像和分析方法,通过对人类3D模型的多个表 性评估来筛选化合物。 

 

材料与方法:

  • ImageXpress®MicroConfocal 高内涵成像系统

  • 带宽场和共聚焦(60μm针孔)光路• MetaXpress® 6 高内涵成像软件 

 

试验开发:

  • 细胞- HCT116人类结肠癌,DU145人类前列腺癌或HepG2肝癌(ATCC)

  • 微孔板– 96或384孔Corning U-型黑色底透板(Corning 4520和3830)
    Hoechst 33342, Calcein AM, Ethidium Homodimer-1, CellEvent-Caspase 3/7, 

  • MitoTracker Orange CMTMRos (Life Technologies/Thermo Fisher)

     

     

 

细胞球形成

我们使用2种不同的检测格式:
1. 在低附着力U型黑色底透板中(1000细胞/孔),形成每孔只有单个细胞球。使用这些孔板去除 了转移细胞球的步骤并且可使它们形成于孔的中心位置,有利于10x或20x下对整个细胞球进行 成像。
2. 多个细胞球生长于固态培养基中(无GFMatrigel基质)。400个细胞接种于1⁄2孔96孔板中。 

 

 

染色:

一步法染料混合物的添加可避免细胞固定及反复洗涤的过程。Calcein AM用来测定具有代 谢活性的细胞、细胞活力和各种形态学参数。Hoechst用来测定总细胞数和细胞核形状。EthD-1 选择性的进入外层细胞膜损伤的细胞以测定死亡和坏死的细胞。染料浓度:Hoechst 15μM, EthD-1 3μM和calcein AM 1μM。Hoechst, calcein AM和EthD-1图像分别选择DAPI, FITC和Texas Red 通道采集。另一方案是4%多聚甲醛固定细胞,0.02%皂素提高细胞膜通透性,Hoechst和鬼笔环 肽连接的AF488进行染色。 

 

结果:使用2D投影的表型分析

成像:

用一个固定补偿值获取仅仅一张图像并不足以比较不同大小或形状的细胞球,所以采集多个焦平面上的 图像是很有必要的。成像方案中采用Hoechst染料对细胞球进行染色。沿聚焦轴(Z-stack)在不同的焦平面上采 集一系列图像并合成经典的目前较大投影图像。 


多参数获取和IC50值

更高分辨率的细胞球成像可以更准确的对单个细胞计数和分类。我们计算图像中的细胞总数,calcein AM 阳性细胞数,EthD-1阴性细胞(活细胞)数和EthD-1阳性细胞(死细胞)数,也包含不同标记细胞的平均面积和荧 光强度。MetaXpress用户自定义模块可进行多参数图像分析,量化不同的生物学结果。使用代表一批不同等 级抗癌药物的化合物来描述细胞球测定的表现。 

图 1. 代表各种表型的细胞球目前较大投影图像。图像分析数据为细胞核计数和细胞分类结果:柱状图:对照(0.1%DMSO), 紫杉醇150nM,依托泊苷200μM,十字孢碱300nM,丝裂霉素C1μM,阿霉素1μM和氟腺嘌呤100μM。几何学或平均强 度值依据DMSO对照进行标准化(设为1000)。已选化合物的浓度依赖作用和4参数曲线拟合。红色-紫杉醇,深红-十字孢 碱,蓝色-阿霉素,绿色-丝裂霉素C,青色-依托泊苷和紫色-氟腺嘌呤。 

 

 

固态培养基多细胞球分析:

采用相同方式进行半固体培养基中细胞球成像及分析。选择共聚焦方式采集图像,沿Z轴间隔5-10um拍 摄各层面图像,再做目前较大投影分析。用户自定义模块可进行单细胞球计数和特征分析,同时也可计算细胞球 中活细胞和死细胞数。化合物处理导致克隆的数量和大小降低,也减少了活细胞数和细胞总数。 

图 2.Matrigel中Hoechst和鬼笔环肽-AF488染色的细胞球目前较大投影图像。由用户自定义模块产生的细胞分类结果的图像分 析数据获取。已选化合物的浓度依赖作用及4参数曲线拟合。红色-依托泊苷,绿色-紫杉醇,蓝色-十字孢碱,紫色-丝裂 霉素C。 

细胞球物体3D特征分析:

3D分析可应用于不同Z平面物体的,也可应用于细胞球或其他物体的3D特征和形态学分析。细 胞球物体分析要求计算所有物体的数量:细胞球或单个细胞,也包括细胞球中的细胞数。多参数图 像分析用来量化不同生物学数据。 

图 3.Hoechst和鬼笔环肽-AF488染色的Matrigel中单个细胞球Z平面。注意不同的焦面有不同的物体。 

 

图 4.Matrigel基质中细胞球计数和Hoechst染色的单个细胞核计数。带有细胞球物体分析功能的用户自定义模块 所获取的图像分析结果。已选化合物的浓度依赖作用及4参数曲线拟合。红色-阿糖胞苷,绿色-顺铂,蓝色-氟腺 嘌呤,紫色-阿霉素。 

总结:

我们已经开发出利用共聚焦系统和高内涵成像的高通量定量检测方法,这一方法可以评价3D癌细胞模型的活力及形态学改变。 

高分辨率和多参数分析利用单细胞计数和分类对各种细胞球表型和药物作用进行统计学特征描述。 

2D和3D分析可对细胞球和单个细胞做特征描述并提供量化的检测数据,这些数据可用于计算IC50s和各种化合物效力的比较。这一方法的有效性也已通过在384孔板格式下对一组抗癌药物的筛选所证明。 

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